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質粒是什么(你的質粒選對了嗎?)

作者/整理:杜克網絡 來源:互聯網 2020-01-07

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質粒是什么(你的質粒選對了嗎?)在實驗室的日常操作中,有一些是人人都需要掌握的實驗技巧。知道的越多,實驗也就更容易成功。

構建重組質粒是分子實驗中常用的實驗方法,本次小編分享閱讀質粒圖譜的幾個技巧,教你快速看懂質粒圖譜。

你的質粒選對了嗎?教你如何快速看懂質粒圖譜

01

看Ori的位置,了解質粒的類型

Ori(復制起始點)的箭頭指復制方向,其他元件標注的箭頭多指轉錄方向(正向),質粒上有多個基因,基因的方向不一樣,所以就有不一樣的箭頭方向。實驗前需要判斷質粒類型(原核/真核/穿梭),根據實驗目的選擇合適的質粒。

02

看上面的標簽

通常會有一兩個蛋白,被用作報告基因,比如常見的copGFP(綠色熒光蛋白),Puro(嘌呤霉素),Lacz(乳糖操縱子)和一些標簽蛋白等。和抗性基因不同,這樣的報告基因,并不是為了在大腸桿菌擴增質粒的過程中起作用的。而是在質粒轉入表達體系后起到作用的,基本上就是為了顯示過表達或是敲減的基因是否正常運作。有的報告基因會融合在蛋白中表達,有的會另外用一個獨立的啟動子進行表達(比如shRNA的質粒中)。

03

看多克隆位點

MCS(Multiple Cloning Site,也就是多克隆位點),一般圖中會把多克隆位點上的酶切位點都標記出來。上面的酶切位點順序,一般都是按照5`-3`的順序排列下來的,需要注意的是這樣幾點。

第一點是要注意,酶切位點邊標注了*的一般是指并不僅僅存在一個位點,也就不能用來作為構建質粒的酶切位點。

第二點需要注意的是,有的酶切位點,在序列中只有一個,但它上面也會標注一個*或者(dam),這說明可能這個酶切位點會有CpG島的甲基化修飾[常見的是XbaI,TCTAG(6m)A中的TC無法切開],一般也是不能用的。但是非要用這個酶切位點的話,就需要用非甲基化的感受態細胞,如JM109或者JM110。

04

看篩選標記

(1)Ampr:水解β-內酰胺環,解除氨芐的毒性。

(2)tetr:可以阻止四環素進入細胞。

(3)camr:生成氯霉素羥乙?;苌?,使之失去毒性。

(4)neor(kanr):氨基糖苷磷酸轉移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。

(5)hygr:使潮霉素β失活。

05

擴展資料

1.根據質粒在細菌內的復制類型可分為兩類:嚴緊控制型和松弛控制型。

嚴緊控制復制型質粒的復制酶系與染色體DNA復制共用,只能在細胞周期的一定階段進行復制,當細胞染色體停止復制時,質粒也就不再復制。

松弛控制復制型的質粒的復制酶系不受染色體DNA復制酶系的影響,在整個細胞生長周期中隨時都可以復制,在染色體復制已經停止時質粒仍能繼續復制。

2.根據質粒能否通過細菌的接合作用,可分為接合性質粒和非接合性質粒。

接合性質粒帶有與接合傳遞有關的基因。非接合質粒在一定條件下通過與其共存的接合質粒的誘動或轉導而傳遞。

3.根據質粒的不相容性,可分為不相容性和相容性。

不相容性指結構相似、密切相關的質粒不能穩定地共存于同一宿主細菌內的現象,反之為相容性。常用于流行病學的調查。

本文來自:公眾號生物新視野原創。

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